废液抽吸与细胞培养|流程与方法

什么是废液抽吸?

废液抽吸(aspiration/suction)为现代生物学技术中常用的技术，用以移除废弃液体。生物学中常见的细胞培养，是将真核或原核细胞培养于适宜的培养液(culture medium)及环境中，使其在受控制的状态下生长(growth)及增殖(proliferation)的过程。细胞培养的流程包含解冻细胞、培养(cell culture)、继代培养(俗称分盘，cell subculture)及冷冻细胞等步骤。

然而，细胞生长过程中会产生代谢物、细胞碎片等废弃物影响细胞健康，甚至导致细胞凋亡。因此在细胞培养过程中，需定期更换培养液，而移除旧有培养液、洗涤液的行为，则为废液抽吸。

真空废液抽吸装置(suction system,aspiration system)常见如上图，主要包含：

真空瓶(vacuum flask)

缓冲瓶(safety bottle)

过滤器(filter)

真空源(vacuum source)

连接并启动真空源后，细胞培养瓶/皿中的废液会因压力差而被抽吸、收集至真空瓶，缓冲瓶则做为防溢装置使用，以避免废液被抽吸至真空源内。过滤器可使用HEPA滤膜(High Efficiency Particulate Air filter或0.22µm过滤器，以过滤掉废液及空气中的粒子、确保抽吸效率。

细胞培养流程

▲细胞培养前，请确认操作环境符合无菌操作条件，且应避免和细菌实验共用设备，以防污染。

解冻细胞(thawing cells)：将冷冻细胞以37 oC快速解冻、回温，以避免细胞损伤。

培养(cell culture)：依据细胞种类和浓度，将细胞和培养基均匀混合后，放入培养箱中培养。

继代培养(cell subculture)：当细胞生长至一定程度后，收集细胞，分殖于新的培养基中。

进行继代培养时，其依细胞种类不同，处理方式可分为以下两大类：

a.附着型细胞(adherent cell)，又称贴壁培养、单层培养(monolayer culture)

去除旧培养基废液

以Phosphate buffered saline(PBS)洗涤细胞一至二次

加入trypsin-EDTA溶液，于37 oC下作用2~20分钟，使细胞可自培养瓶/皿中脱落

加入含有血清的新鲜培养基中，以终止胰蛋白酶作用

将脱落的细胞及其团块打散、混合均匀后，收集所有液体

离心后移除上清液，并添加新鲜培养基，依稀释比例转移至新的培养瓶/皿中进行培养

b.悬浮型细胞(suspension cell)，又称悬浮培养(suspension culture)

将细胞培养液以1000 rpm离心5分钟后，吸除上清液

加入适量新鲜培养基，与沉淀细胞混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶/皿中进行培养。

冷冻细胞(cryopreservation)：获得目标细胞株后，将细胞悬浮于含有5~10%DMSO(二甲基亚砜，dimethyl sulfoxide)及30~50%FBS(胎牛血清，Fetal Bovine Serum)的新鲜培养液中，以-80 oC或液态氮等低温设备保存。

细胞计数(cell counting)：用以计算细胞浓度，可利用传统血球计数器(Neubauer chamber)或自动计数器，计算细胞浓度可用来判断目前细胞生长的情况。

废液抽吸方法的比较

废液抽吸目前有多种方法可以进行。早期实验室多利用移液器(pipette)或电动吸管抽吸废液，然而因为需要重覆抽吸及排除液体，长时间使用下来易造成手部不适及疲劳。除此之外，电动吸管须搭配无菌刻度吸管使用，而现多使用抛弃式吸管排除污染疑虑，因此一次实验下来通常会产生大量废弃物，造成环境负担。

现代实验室则普遍会自行购置真空帮浦搭配真空瓶自行组装，如此会较电动吸管有效率，且设备取得较容易，然而自组式系统常见许多例如：管线配置不良，造成工作环境混乱、或是玻璃吸管经常破裂等安全性上的缺点。

Lafil废液抽吸系统及BioDolphin废液抽吸套件主要为生命科学细胞培养或实验过程中溶液抽吸应用，可直接放置于无菌无尘操作台(laminar flow)使用。Lafil废液抽吸系统整合真空源、真空瓶与废液抽吸套件，提供实验室一体化解决方案，更比传统废液抽吸系统减少一半檯面占用面积，并使用围篱式平台固定真空瓶，避免操作者不小心碰触瓶身而倾倒。

洛科Lafil废液抽吸系统及BioDolphin废液抽吸套件

细胞培养实验室基础设备

废液处理与废弃办法

含有危险化学品（如氯）之有机废液应收集至设有适当标示之专用废液桶，不含危险化学品之其它废液可一併收集于一般混合废液桶，废油则需收集于废油桶中。细胞培养用的废液应加入适当浓度的消毒剂，如漂白水(次氯酸钠Sodium Hypochlorite)，使细胞致死，再倒入水槽或废液桶。培养皿等生物医疗相关废弃物则应置于生物医疗废弃物袋中，进行高温高压灭菌后以一般废弃物丢弃，或是请依照我国生物医疗废弃物相关规定处理。

参考资料

Cell Culture Basics:Equipment,Fundamentals and Protocols|Technology Networks

Cell Culture Basics,EU(vanderbilt.edu)

Cell Culture Fundamentals:Safety Aspects of Cell Culture,Sigma-Aldrich

Cell culture protocol,Proteintech

Cell culture|细胞培养，ACE Biolabs

Laboratory Environmental Sample Disposal Information Document,Section 6.0,2010,US EPA

TISSUE CULTURE WASTE DISPOSAL GUIDELINES,2017,Laboratory Safety,THE GEORGE WASHINGTON UNIVERSITY

Tissue Culture Waste Disposal Guide,2022,EHS,Weill Cornell Medicine

行政院环境保护署，事业废弃物贮存清除处理方法及设施标准，环署循字第1111016706号

细胞继代培养，生物资源保存及研究中心-BCRC小教室